Politeknik Kesehatan Kupang berdiri tanggal 16 April 2001 dengan SK Menteri Kesehatan dan Kesejahteraan Sosial R.I Nomor 298/SK/IV/2001 tentang Organisasi dan Tata kerja Politeknik Kesehatan. Pada awalnya merupakan gabungan dari lima Akademi milik Departemen Kesehatan (Depkes) yaitu: Akademi Keperawatan Kupang, Akademi Kebidanan Kupang, Akademi Kesehatan Lingkungan Kupang, Akademi Keperawatan Ende dan Akademi Keperawatan Waingapu. Sesuai SK Menkes R.I. No. HK.00.06.1.4.2.02225 tentang Penataan Lokasi Pelaksanaan Program Studi Pada Beberapa Jurusan di Politeknik Kesehatan Padang, Mataram, Kupang, Pontianak, Banjarmasin, Manado dan Makasar maka tahun 2005 dilakukan penggabungan 2 (dua) Akademi yaitu Akademi Kesehatan Gigi Kupang dan Akademi Farmasi Kupang dan tahun 2006 dibuka Program Studi Gizi Kupang berdasarkan Keputusan Menteri Kesehatan R.I. No. OT.01.01.1.4.2.04540.1 tentang Pembentukan Program Studi Gizi pada Jurusan Kebidanan di Politeknik Kesehatan Departemen Kesehatan Kupang.
Politeknik Kesehatan Departemen Kesehatan Kupang sesuai Permenkes No.890/Menkes/Per/VIII/2007 tanggal 02 Agustus 2007 tentang Organisasi dan Tatakerja Politeknik Kesehatan memiliki 6 (enam) Jurusan dan 3 (tiga) Program Studi yaitu Jurusan Keperawatan Kupang terdiri dari Program Studi DIII Keperawatan Ende, Program Studi DIII Keperawatan Waingapu, dan Program Studi DIV Keperawatan Medikal Bedah Kupang sesuai SK Menteri Kesehatan Republik Indonesia No.OT.01.01.1.4.2.01969.1 tanggal 23 April 2007, Jurusan Kebidanan Kupang, Jurusan Kesehatan Lingkungan Kupang, Jurusan Kesehatan Gigi Kupang, Jurusan Farmasi Kupang dan Jurusan Gizi Kupang. Pada tanggal 28 April 2009 dibuka Program Studi Analis Kesehatan pada Jurusan Farmasi Kupang, berdasarkan Surat Keputusan Kepala Badan PPSDM Kesehatan Departemen Kesehatan RI No.HK.03.05/I/II/4/2097.1.
Cikal bakal adanya Prodi Keperawatan Waingapu Poltekkes Kemenkes Kupang, tahun 1988 telah didirikan Sekolah Perawat Kesehatan berdasarkan SK.Menkes RI Nomor 1778/ Kep/ Diknakes/ VIII/ 1985. Kemudian pada tahun 1999 berubah status menjadi Akademi Keperawatan Waingapu berdasarkan SK. Kapusdiknakes Depkes RI No.HK.00.06.11.1.1998. Pada tanggal 16 April 2001 dilakukan serah terima dari Akademi Keperawatan Waingapu menjadi Program Studi DIII Keperawatan Waingapu Poltekkes Kupang berdasarkan SK. Menkes No.HK.00.06.1.4.2.02225. Kemudian berdasarkan peraturan Permenkes nomor 298/MENKES-KESOS/SK/IV/2001.
Pada tahun 2001, berdasarkan Surat Keputusan Menteri Kesehatan dan Menteri Kesejahteraan Sosial RI Nomor 298/MENKES-KESOS RI/SK/IV/2001 tentang Organisasi dan Tata Kelola Politeknik Kesehatan maka terbentuklah Politeknik Kesehatan Kemenkes Kupang yang terdiri dari Jurusan Kesehatan Lingkungan, Jurusan Keperawatan dan Jurusan Kebidanan ditambah dengan Program Studi Keperawatan Waingapu dan Program Studi Keperawatan Ende.
Saat ini, Politeknik Kesehatan Kemenkes Kupang memiliki 12 Program Studi yang terdiri dari Program Studi DIII Kebidanan, Program Studi DIII Sanitasi, Program Studi DIII Farmasi, Program Studi DIII Teknologi Laboratorium Medis, Program Studi DIII Kesehatan Gigi, Program Studi DIII Gizi, Program Studi Sarjana Terapan Keperawatan Kupang, Program Studi Profesi Ners, Program Studi DIII Keperawatan Kupang, Program Studi DIII Keperawatan Ende, Program Studi DIII Keperawatan Waingapu dan Program Studi DIII Keperawatan Waikabubak.
Dalam rangka meningkatkan kinerja layanan pada semua bidang, Poltekkes Kemenkes Kupang telah menerapkan Pengelolaan Keuangan Badan Layanan Umum (PK-BLU) pada tahun 2019 berdasarkan Keputusan Menteri Keuangan RI No: 62/KMK.05/2019.